1.2.4细胞培养和转染以RPMI 1640（含100 mL/L胎牛血清）常规培养细胞（37℃，50 mL/L CO2）. 细胞转染：收集对数生长期的HEK293细胞，以6×105/孔接种于6孔培养板，待细胞长至90%接触时换无血清RPMI 1640 2 mL备用. 分别以250 μL无血清的RPMI 1640溶解4 μg的质粒DNA和稀释5 μL的LF2000 Reagent，混合后置室温下孵育20 min，分别加入已预备好的各组细胞并混匀，常规培养6 h后换全培养基继续培养，24～48 h内可进行瞬时分析，48 h后更换选择性培养基（含G418 200 mg/L）筛选稳定表达克隆，约2 wk时（对照组细胞基本死亡），挑取实验组阳性克隆，逐步扩大培养，RTPCR鉴定后建立稳定传代的细胞系，仍以选择性培养基（G418 200 mg/L）传代培养.

　　1.2.5转染细胞中融合蛋白表达的观察采用激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS SP）对瞬时和稳定转染后的细胞进行荧光观测，并确定其表达的亚细胞区域，以计算机进行成像分析.

　　统计学处理：χ2检验，采用SPSS 10.0软件进行数据处理.

　　2结果

　　2.1EB病毒BamHI W片段的检测在鼻咽活检组织、外周血淋巴细胞和除阴性对照BJAB外的所有细胞株中均检测到了192 bp的EB病毒BamHI W片段（Fig 1），表明EB病毒感染在各标本中广泛存在.

　　2.2RPMS1 mRNA在鼻咽癌组织中的表达RPMS1基因在鼻咽癌组织中的表达率为83.3%（45/54），在鼻咽非癌组织（黏膜慢性炎症）中仅为4%（1/25），二者有显著性差异（P<0.001, Fig 2A)；14例鼻咽癌外周血淋巴细胞中未检测到RPMS1 (Fig 2A)；鼻咽癌细胞株SUNE1中RPMS1的表达高于Raji细胞(Fig 2B)，不表达于B95.8细胞，表明RPMS1基因高表达于鼻咽癌组织和细胞株，在淋巴细胞株中表达较低，在鼻咽癌外周血淋巴细胞中不表达.

　　2.3RPMS1基因的克隆及其重组质粒的鉴定将RPMS1基因克隆入pGEMT easy载体，鉴定后亚克隆入pEGFPC2，成功建立重组表达质粒pEGFPC2/RPMS1，PCR及BamH I和Hind III双酶切鉴定均可见到360 bp的扩增片段(Fig 3)，与理论设计长度相符，该重组质粒可用于下一步的细胞转染研究.

　　2.4RPMS1在HEK293细胞中的表达及其定位以pEGFPC2/RPMS1重组质粒转染HEK293细胞，可见瞬时（24 h）和稳定转染（第20代）的细胞中均出现RPMS1 mRNA（Fig 4）及其融合蛋白表达，在激光扫描共聚焦显微镜下，可以清楚地观察到RPMS1融合蛋白呈斑片状表达于细胞核（Fig 5A），当以红色为其阳性背景时，黄色为其最强表达，同样观察到RPMS1融合蛋白表达于细胞核（Fig 5B），而空载体转染组细胞中GFP的绿色荧光在整个细胞中均一表达（Fig 5C），未转染组细胞无绿色荧光出现（Fig 5D）.

　　3讨论

　　RPMS1基因是BARTs家族唯一确定了全长cDNA结构的成员， 其编码结构由BARTs基因第Ⅳ,Ⅴ
1外显子剪接而成，属该家族最丰富的转录剪接形式［3,4］. 我们的前期工作曾发现其编码序列的151 nt发生碱基替换（g→a），导致相应的第51位氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰氨（D→N），该结果与本研究室在其第Ⅴ外显子155849 nt位点发现的高频变异相一致，编码序列的变异高度提示该基因参与鼻咽上皮的癌变过程. 我们发现RPMS1基因在高发区鼻咽癌组织中存在高水平转录，与鼻咽非癌组织相比差异显著（P<0.001），高度提示该基因与高发区鼻咽癌的发生发展相关；RPMS1在鼻咽癌细胞系SUNE1中高水平表达，但在Raji细胞中表达下调，在B95.8细胞中则不表达，在鼻咽癌外周血淋巴细胞中也未检测到该基因转录，该结果与目前报道基本一致［5］，表明RPMS1可能主要参与EB病毒在上皮细胞中的生物学活动.

　　GFP是目前广泛应用于活细胞和组织内基因表达及蛋白定位的一种新型分子标记物，可以快速而准确地指示融合蛋白的表达及其部位［6］，结果显示RPMS1融和蛋白可稳定表达于上皮细胞的胞核，提示RPMS1蛋白可能以细胞核为其功能活动区域. RPMS1编码蛋白与转录因子CBF1存在相互作用［5,7］，通过与Notch IC竞争性结合CBF1从而维持其转录抑制功能，继而抑制Notch通路活性，而EB病毒另一重要基因EBNA2正是通过与Notch IC竞争结合CBF1、进而抑制Notch IC活性来发挥其永生化B细胞的功能［8］. 进一步的研究表明，RPMS1可通过与CBF1及其辅阻遏物CIR的相互作用而负性调节Notch/ EBNA2信号通路活性［7］. 因此，RPMS1蛋白的核内表达进一步表明RPMS1可能作为核转录因子通过调控相关通路活性参与细胞的生长转化过程.

　　RPMS1的表达特点及其定位信息表明该基因可能参与上皮癌变过程，并与高发区鼻咽癌的发生发展有密切关系. 本研究为进一步研究RPMS1的生物学功能及其参与鼻咽癌变的分子机制奠定了基础.

　　【参考文献】

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　　［4］ Smith P, De Jesus O, Turner DJ, et al. Structure and coding content of CST (BARTs) family RNAs of EpsteinBarr virus ［J］. J Virol, 2000; 74(7): 3082-3092.

　　［5］ Chen H, Smith P, Ambinder RF, et al. Expression of EpsteinBarr virus BamHI A rightward transcripts in latently infected B cells from peripheral blood ［J］. Blood, 1999; 93(9): 3026-3032.

　　［6］ Anna C, Elena R, Valeria T, et al. Recombinant aequorin and green fluorescent protein as valuable tools in the study of cell signaling ［J］. Biochem J, 2001; 355: 1-12.

　　［7］ Zhang J, Chen HL, Weinmaster G, et al. EpsteinBarr virus BamHIA Rightward Transcriptencoded RPMS protein interacts with the CBF1associated corepressor CIR to negatively regulate the activity of EBNA2 and Notch IC ［J］. J Virol, 2001; 75: 2946-2956.

　　［8］ Hsieh J, Henkel T, Salmon P, et al. Truncated mammalian Notch1 activates CBF1/RBPJrepressed genes by a mechanism resembling that of EpsteinBarr virus EBNA2 ［J］. Mol Cell Biol, 1996; 16: 952-959.