Relationship between expression of p73α and p53 and chemosensitivity in breast cancer
【Abstract】 AIM: To investigate the relationship between the expression of p73α and p53 in breast cancer cells and chemosensitivity. METHODS: Twelve surgical samples of pathologically diagnosed breast cancer were used. The cancer cells were isolated and cultured in the incubator at 37℃, 50 mL/L CO2 in vitro. The inhibitory rates of cancer cells by 4 kinds of anticancer drugs (EPI, MMC, 5FU and DDP) were assayed by MTT method. Immunocytochemistry was used to detect the expression of p73α and p53 in the cancer cells. RESULTS: The sensitivity of the 12 breast cancer cells in 0.1×PPC within 72 h in vitro was 42% (MMC), 33 % (EPI) and 17% (both 5FU and DDP). The inhibitory rates of MMC, EPI, 5FU and DDP were significantly higher in p73α positive cancer cells than in p73α negative cancer cells. A positive correlation was found between the expression of p73α and chemosensitivity in all the four anticancer drugs. CONCLUSION: The expression of p73α is related to the chemosensitivity of the breast cancer cells and it can be used as one of the markers for clinical assessment of the effect of chemotherapy.
【Keywords】 breast neoplasms; genes, p73α; genes, p53; chemosensitivity
【摘要】 目的： 研究乳腺癌细胞p73α、p53表达与化疗药物敏感性的关系. 方法： 选取病理诊断为乳腺癌（术前未行放疗、化疗）的手术切除标本12例，体外分离细胞作培养，应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法分析表阿霉素（EPI）、丝裂霉素（MMC）、5氟脲嘧啶（5FU）、顺铂（DDP）4种化疗药物对乳腺癌细胞的相对抑制率，通过免疫细胞化学染色法分析乳腺癌细胞p73α、p53的表达. 结果： 0.1×PPC浓度时乳腺癌细胞对4种化疗药物的敏感率分别为MMC（42%）、EPI（33%）、5Fu（17%）、DDP（17%）；p73α（）的乳腺癌细胞对4种化疗药物敏感性均高于p73α（）的乳腺癌细胞（P<0.05），p73α阳性表达程度与乳腺癌细胞对EPI、MMC、5Fu、DDP4种化疗药物的敏感性存在正相关关系（r=0.736, P<0.05; r=0.744, P<0.05; r=0.674, P<0.05; r=0.721, P<0.05）. 结论： p73α的表达与乳腺癌细胞对化疗药物敏感性有关.
【要害词】 乳腺肿瘤；基因，p73α；基因，p53；化疗敏感性
0引言
乳腺癌临床化疗有效者能显著延长生存期，对化疗药物的反抗被认为是乳腺癌化疗失败的原因之一. 目前对乳腺癌的化疗多是依据临床经验选择相应化疗方案，使治疗存在盲目性，因此有必要寻找一些能对乳腺癌化疗疗效起猜测作用的指标，以指导临床化疗提高疗效. 我们采用体外培养的人乳腺癌细胞，应用MTT法及免疫细胞化学染色法，研究p73α, p53表达与乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的关系如下.
1材料和方法
1.1材料
我院经病理诊断为乳腺癌，术前未经放疗、化疗的手术切除的新鲜癌组织12例，放入不含小牛血清的RPMI1640培养液中迅速送往实验室. 将表阿霉素(EPI)、丝裂霉素(MMC)、5氟脲嘧啶(5FU)、顺铂(DDP)分别用生理盐水配制成母液，再用培养液配成100×PPC浓度工作液（PPC是血浆峰值），正压过滤除菌，20℃保存.RPMI1640干粉培养基（Hyclone产品）;四甲基偶氮唑盐（MTT, Sigma产品）;100 mL/L小牛血清（杭州四季青）;二甲基亚砜（DMSO，分析纯为重庆化学试剂厂）；p73α兔抗人多克隆抗体（武汉博士德生物公司）；p53鼠抗人mAb、SP试剂盒 (北京中山生物技术公司).
1.2方法
采用机械法获取癌细胞单细胞悬液，先将标本用生理盐水（含青霉素300 ku/L、链霉素300 ku/L）反复冲洗，去除坏死组织和血凝块，置于无菌平皿中，加入少许培养液，用眼科剪反复剪切成糊状，200目不锈钢网过筛；经台盼蓝染色计数活细胞数≥95%；以1000 r/min离心10 min；用RPMI1640完全培养液（含100 mL/L小牛血清、含青霉素100 ku/L、链霉素100 ku/L）调整细胞浓度为5×107/L，接种于96孔板，每孔180 μL；接种细胞分别加入化疗药液20 μL（药物终浓度为10, 1, 0.1×PPC），每个浓度3个复孔；并设细胞对照组（加细胞不加药）和空白对照组（只加培养液），细胞对照组、空白对照组均加入培养液20 μL；置37℃，50 mL/L的CO2培养箱培养. 使用的药物为EPI，MMC，5FU和DDP，并按这些药物分组，每组12例. 加药培养68 h后，离心去上清，每孔加入RPMI1640完全培养液180 μL, MTT溶液20 μL再培养4 h，离心去上清，加入DMSO 200 μL，震荡15 min使沉淀充分溶解，用酶标仪（600 nm）测每孔吸光度（A）值，按下列公式计算相对抑制率：相对抑制率=（A对照-A加药）/A对照×100%. 根据0.1×PPC 浓度时的相对抑制率判定肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，相对抑制率<30%为不敏感，30%~50%为敏感，>50%为中度敏感. 将肿瘤细胞涂于载玻片，晾干后用950 mL/L的酒精固定，置4℃冰箱备用. p73α、p53免疫细胞化学按照SP试剂盒说明书操作. 细胞质内出现棕色颗粒为 p73α阳性细胞，p53阳性细胞为细胞核内出现棕黄色颗粒；参照文献［1］标准：无阳性细胞或阳性细胞数<10%为（），阳性细胞数10%~50%记为（ ），阳性细胞数51%~75%记为（），阳性细胞数>75%记为（）. 阳性细胞数≥10%均视为阳性表达.
