3.3 克林霉素ChP［2c］测定盐酸克林霉素中克林霉素含量的RPHPLC系统与BP和USP［3b，4b］不同，ChP的流动相为甲醇∶pH30磷酸盐缓冲液(含25mmol/L磷酸二氢铵 4mmol/L磷酸)(45∶55)，BP和USP的流动相为乙腈∶pH75磷酸盐缓冲液(含50mmol/L磷酸二氢钾和40mmol/L氢氧化钾)(42∶58)。ChP采用与BP相同的进样量，但克林霉素峰具有典型的过载特征(Fig.3A)。另选用其他C18柱(Kromasil C18、Inertsil ODS3、Hypersil BDS C18、Discovery C18、Shimpack CLCODS和LiChrospher 100 RP18e)实验，结果也如此。如选用BP的色谱系统，则克林霉素的峰形较为对称，表观柱效亦较高(Fig.3B)。参考BP的色谱系统，以甲醇代替乙腈，并适当增加甲醇的浓度以使克林霉素具有几乎相同的保留时间，则流动相的离子强度减半，拖尾因子和峰宽仅稍增加；在ChP的流动相中添加中性盐或缓冲液浓度增加1倍，拖尾因子显著降低，但表观柱效亦相应降低；如流动相的缓冲液浓度增加4倍，则峰形明显改善，拖尾因子和峰宽均降低，但色谱峰仍具有过载的特征(Fig.3C)；如缓冲液浓度增加4倍并以乙腈代替甲醇，同时适当减少乙腈的浓度，流动相的离子强度增加近6倍，但峰形却未见显著改善。上述实验结果表明，克林霉素在固定相上的过载不仅仅与流动相的离子强度有关。在低pH值的流动相中，反相色谱柱易于为质子化的碱性化合物所过载；在色谱柱均过载的情形下，采用低pH值(pH2~3)流动相所得的色谱峰形明显不同于采用高pH值(pH7)流动相所得的色谱峰形，后者的峰形更复杂，后者同时还具有明显的指数拖尾(exponential tailing)也即动力学拖尾(kinetic tailing)的特征，提示在高pH值时除疏水相互作用外，还存在离子交换的相互作用［11］；填料表面在高pH值流动相中出现阳离子交换位点，相应地增加了色谱柱的容量；流动相中反离子的化合价较高时(如BP流动相中的H2PO2-4之于ChP流动相中的H2PO-4)，反离子可与一个以上的有机离子形成中性离子对复合物［24］，相应地减少了吸附在固定相表面的克林霉素分子及其相互间的静电排斥效应，增加色谱柱的饱和容量。此外，流动相中选用不同的有机溶剂，有可能影响固定相的构象以及被测物在固定相表面的吸附和分配，导致不同的色谱峰形。由于在含有乙腈或甲醇的流动相中，碱性化合物的pKa值通常可随着有机溶剂浓度的增加而逐渐降低［30，35］，故克林霉素(pKa值为76［36］)在BP流动相中只有少量以质子化的形式存在，因而吸附在固定相表面的离子化的克林霉素分子极少，克林霉素分子相互间的静电排斥效应较小，这使得色谱柱的饱和容量较高；克林霉素在ChP流动相中则全部是以质子化的形式存在的，故吸附在固定相表面的克林霉素分子均以离子化的形式存在，其相互间的静电排斥效应较大，致使色谱柱的饱和容量相应较低。磷酸盐(磷酸的pKa值为22，71，123［15c］)在ChP流动相中主要以H2PO-4的形式存在。流动相中缓冲盐的种类不同，则色谱柱的饱和容量、色谱峰形以及表观柱效等均不相同［9，10，27］；流动相中选用不同种类的无机反离子，质子化的碱性化合物峰的理论板数和拖尾因子均显著不同，在已测试的四种反离子中，使拖尾因子降低、表观柱效增加的趋势如下：六氟磷酸根(PF-6)＞高氯酸根(ClO-4)＞四硼磷酸根(BF-4)＞H2PO-4［27］。向ChP流动相的缓冲液中添加01mol/L NaClO4，虽然流动相的离子强度仅增加3倍，但克林霉素峰的拖尾因子显著降低，表观柱效和保留时间亦显著增加，唯克林霉素与紧邻的未知杂质的分离度并未如预计地显著增加，提示高浓度的ClO-4在该流动相中可能作为对离子改变了色谱系统的选择性。

　　Fig.3 （略）

　　3.4 青霉素GUSP［4d］测定青霉素G钾中青霉素G含量的RPHPLC系统与BP［3d］不同，USP的流动相为甲醇∶10mmol/L磷酸二氢钾溶液(40∶60)，BP的流动相则为甲醇∶pH35磷酸盐缓冲液(80mmol/L磷酸二氢钾 3mmol/L磷酸)(35∶65)。USP的进样量是BP的进样量的1/20，选用USP的流动相和进样量，青霉素G峰形比较对称，增加进样量则峰形具有过载的特征(Fig.4A)。另选用其他C18柱(Kromasil C18、Inertsil ODS3和TSK GEL ODS100S)实验，结果也如此。改用BP的流动相，青霉素G峰形对称且几乎不受进样量大小的影响。如将USP的流动相中的磷酸二氢钾浓度增至50mmol/L，同时甲醇浓度增至50%，则峰形显著改善，但仍稍具过载特征(Fig.4B)；继用磷酸调节磷酸二氢钾溶液的pH值至35，则峰形进一步改善(Fig.4C)。USP流动相中的磷酸二氢钾溶液(pH43)非缓冲液，实为几无缓冲容量的盐溶液，易导致缓冲液过载［7］，如进样量较大则难以控制青霉素G在流动相中的解离即二次化学平衡，且流动相的离子强度较低，故色谱峰形随着进样量的增加而显著展宽(Fig.4A)。将流动相中磷酸二氢钾的浓度增至50mmol/L，增加了流动相的缓冲容量和离子强度，色谱峰形相应改善(Fig.4B)；进一步调节磷酸二氢钾溶液的pH值至35，则流动相的缓冲容量显著增加，且由于在含有乙腈的流动相中，化合物酸性基团的pKa值随着乙腈浓度的增加而逐渐增加［29，34］，故青霉素G的羧基［pKa值为27(http://www.usp.org/pdf/veterinary/penicillinGin.pdf)］在流动相中的解离被抑制，相应地减少了吸附在固定相表面的离子化的青霉素G分子及其相互间的静电排斥效应，使色谱柱的容量、表观柱效以及青霉素G的保留时间均相应增加，青霉素G在色谱过程中呈现出类似于中性化合物的色谱行为和色谱峰形(Fig.4C)。类似的例子还有头孢噻吩：ChP［2d］测定噻吩钠中头孢噻吩含量的RPHPLC系统与BP和USP［3e，4e］不同，ChP的流动相为乙腈∶165mmol/L乙酸溶液(pH28)(1∶3)，离子强度仅为13mmol/L，进样量较大(05mg/ml，12mmol/L，10μl)，故头孢噻吩峰具有典型的过载特征；BP和USP的流动相为乙腈∶乙醇∶pH59乙酸盐缓冲液(含260mmol/L乙酸钠和15mmol/L乙酸)(15∶7∶79)，离子强度高达205mmol/L，虽进样量更大(1mg/ml，10μl)，但头孢噻吩的峰形较为对称，表观柱效亦较高(图略)。头孢西丁：BP和USP［3f，4f］的流动相分别为水∶乙腈∶乙酸(81∶19∶1)和水∶乙腈∶乙酸(84∶16∶1)，离子强度仅为18mmol/L，缓冲容量较低(84mmol/L)，进样量较大(BP：1mg/ml，22mmol/L，20μl；USP：03mg/ml，07mmol/L，10μl)，头孢西丁峰具有典型的过载特征。头孢米诺：日抗基［37］的含量测定用流动相为：175mmol/L乙酸溶液(pH28)∶甲醇∶四氢呋喃(990∶5∶5)，离子强度仅为18mmol/L，且乙酸溶液实为几无缓冲容量的盐溶液(缓冲容量为84mmol/L)，进样量较大(5mg/ml，106mmol/L，5μl)，故头孢米诺峰具有典型的过载特征。哌拉西林：ChP［2e］的含量测定用流动相为含10mmol/L磷酸二氢钠和2mmol/L氢氧化四乙基铵的甲醇∶水(4∶6)(用磷酸调节pH值至55)，离子强度亦较低，约为12mmol/L，哌拉西林峰具有典型的过载特征。万古霉素：BP和USP［3g，4g］的有关物质检查用流动相为14mmol/L磷酸三乙胺缓冲液(pH32)∶乙腈∶四氢呋喃(92∶7∶1)，离子强度低至14mmol/L，万古霉素B峰亦具有过载的特征。

　　Fig.4 （略）

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